А.М.Федунь, М.В.Кукош, А.С.Гордецов

Государственная медицинская академия, Нижний Новгород

Роль инфракрасной спектроскопии сыворотки крови в комплексной диагностике рака легкого

Ежегодно в России заболевают раком легкого (РЛ) свыше 63000 человек, в том числе 53000 мужчин. Более чем у 20000 выявляется IV стадия заболевания. Умирает ежегодно от РЛ свыше 60000 человек, что составляет более 20% от всех умерших от злокачественных новообразований [1]. Практически у 2/3 первично выявленных больных диагностируется РЛ III и IV стадий. В течение первого года умирают 80%, лишь около 10% больных имеют шанс прожить более 5 лет [2], а при мелкоклеточном раке этот показатель составляет лишь 1-3% [3]. РЛ имеет наихудший прогноз среди всех раковых заболеваний [4]. Успехи его хирургического лечения тесно связаны с проблемой ранней диагностики.

Большое число больных, выявляемых в III и IV стадиях заболевания РЛ, и низкая пятилетняя выживаемость после радикальных операций свидетельствуют о том, что применяемые методы диагностики этой болезни еще недостаточно эффективны. Важность ранней диагностики подтверждается данными пятилетней выживаемости после радикальных операций. Так, этот показатель составляет при первой стадии – 63,5%, при второй – 43,5% и при третьей – 22,9% ⁵.

Низкий показатель пятилетней выживаемости после радикальных операций даже при I стадии свидетельствует о наличии у ряда больных метастазов, выявление которых на современном этапе развития науки вызывает большие трудности. Соответственно больным определяется неправильная стадия болезни и назначается неадекватное лечение. Сложность проблемы состоит еще и в том, что надежных методов ранней диагностики РЛ в настоящее время нет ⁶. Наиболее эффективным методом является рентгено-эндоскопическое исследование ⁷.

В последние годы все большее значение приобретают исследования, направленные на изучение биологической активности опухоли ^{8, 9}.

Перспективным, но весьма малоизученным направлением научных поисков в диагностике заболеваний легких является исследование физико-химических характеристик сыворотки крови ¹⁰.

Цель исследования – разработка нового, дополнительного метода выявления больных РЛ на основе инфракрасной (ИК) спектроскопии сыворотки крови и определения его роли в комплексной диагностике заболевания.

ИК-спектроскопия является одним из типов колебательной спектроскопии, который исследует колебания молекул.

При любой температуре выше абсолютного нуля все маленькие простые гармонические осцилляторы, из которых состоит молекула, весьма энергично колеблются. ИК-свет имеет тот же частотный диапазон, что и колеблющаяся молекула. Поэтому, если ИК-свет попадает на колеблющуюся молекулу, то она поглотит те частоты этого света, которые в точности совпадают с частотами собственных различных гармонических осцилляторов. После поглощения этого света маленькие осцилляторы в молекуле будут продолжать колебаться на той же частоте, но амплитуда их колебаний увеличится. Оставшийся свет, который не поглотился ни одним из осцилляторов молекулы, проходит через образец на детектор. Компьютер анализирует прошедший свет и определяет, какие частоты были поглощены.

Группы атомов молекулы колеблются на своих собственных частотах, но их различия этим не ограничиваются. Существует шесть различных способов, которыми может колебаться молекула. Каждый из них может реализоваться в любой молекуле, но все эти способы характеризуются различными частотами, поэтому получается очень большое количество различных колебаний. Путем измерения множества ИК-спектров у большого числа известных химических соединений и выяснения, на какой частоте поглощает каждая из групп, определили, где проявляется поглощение, соответствующее различным группам. На основании этого были составлены эталонные таблицы.

Колебательные спектры обладают очень высокой специфичностью и являются уникальной физической характеристикой вещества. И поскольку не существует двух веществ с абсолютно одинаковыми ИК-спектрами, это широко используется для идентификации индивидуальных химических соединений, каждому из которых соответствует свой неповторимый спектр. Не случайно поэтому колебательный спектр сравнивают с дактилоскопическим отпечатком. Областью «отпечатков пальцев» выступает область частот ИК-спектра ниже 1500 см-1, в которой общая картина спектра наиболее чувствительна к малейшим изменениям в структуре молекулы и вещества ¹¹.

Теоретическим обоснованием проводимых нами исследований явилась гипотеза о наличии в крови веществ, несущих информацию о нарушении химического гомеостаза системы дыхания.

В качестве исследуемого материала мы использовали сухую сыворотку крови. Образец готовился в виде суспензии в вазелиновом масле. Регистрация спектров производилась на спектрофотометре ф. Carl Ceiss Jena «Specord 75 IR», в диапазоне волновых чисел 1170-1025 см-1, который охватывает длины волн от 8,55 до 9,76 мкм и, соответственно, относится к средней области (2,0-50 мкм) ИК-спектра. На полученной спектрограмме измеряли высоту 8 пиков полос поглощения, соответствующих определенным волновым числам (1170, 1165, 1150, 1140, 1130, 1100, 1070, 1025 см-1). За ИК-спектроскопические параметры принимали частные, полученные в результате деления высот пиков полос поглощения друг на друга, в качестве делителя также использовалось среднее значение высот всех определяемых пиков – Ср (табл. 1): X=1125/Ср, S=1100/Ср, R=1165/1070. Кроме того, использовали следующие параметры: М – значение высоты наибольшего из изучаемых пиков поглощения, а ММАL – соответственно наименьшего; за параметр С принимали среднее значение всех определяемых частных.

Клиническому изучению подвергся 71 пациент (63 мужчины и 8 женщин) в возрасте от 40 до 76 лет с РЛ. Периферическая кровь была получена у них до хирургического вмешательства. Диагноз у всех пациентов был подтвержден гистологически, у 95% больных злокачественной неоплазией был немелкоклеточный рак легкого. У 25% больных РЛ была диагностирована I стадия болезни, у 15% – II, у 52% – III, и у 8% – IV стадия. Для сравнения мы использовали ИК-спектры 33 образцов сухой сыворотки крови, взятых у считающих себя здоровыми людей.

Статистическая обработка полученных данных проводилась параметрическими методами с использованием компьютерных программ статистической обработки «Exсel 7» и «STATISTIСA 99», поскольку после анализа вида распределения изучаемых признаков методом построения 2М-гистограмм выяснилось, что они подчиняются нормальному распределению в каждой из групп сравнения.

При оценке структуры взаимосвязи показателей ИК-спектров у лиц контрольной группы была установлена прямая корреляция между показателями М и С (r=0,97), остальные также имели определенные элементы корреляции между собой и поэтому были самостоятельно значимыми.

При анализе ИК-спектров сыворотки крови больных РЛ без учета гистологической формы и степени распространенности процесса отмечено, что у 6 из 8 параметров среднее арифметическое отклоняется от среднего арифметического однотипного референтного показателя в сторону уменьшения (R, X, S, Q, MMAL, C), а для двух других коэффициентов характерно увеличение его по сравнению со значениями у группы лиц без патологии в бронхолегочной системе (Z, M) (см. табл. 1).

Как видно из таблицы, у больных РЛ и лиц контрольной группы наиболее сильно отличались значения средних арифметических у следующих параметров: R, S, Q, M, но только у двух из них разница превысила значение среднего квадратического отклонения и составила для p < 0,173, а для Q – 0,289. С целью выяснения существенности различий между средними арифметическими показателей ИК-спектроскопии у больных РЛ и контрольной группы был использован двухвыборочный t-критерий Стьюдента. Выявлено достоверное различие показателей S, R, Q, с уверенностью превышающее 99%, т. е. согласно таблицы Стьюдента при t>2,58 (число степеней свободы больше 30) доверительная вероятность равна 0,99, а уровень значимости p < 0,01. Достоверное различие показателя М с уверенностью превышает 90% (t>1,65,p>0,1).

Чтобы удостовериться в различии признаков S, R, Q у двух исследуемых групп, а также наглядно продемонстрировать его, мы сравнили их доверительные границы (табл. 2). Известно, что если сравниваемые доверительные границы не совпадают, то различия средних арифметических следует признать неслучайными [12].

Полученные доверительные границы сравниваемых средних арифметических показателей Q и R не совпадают и поэтому следует считать различия между ними существенными с весьма высокой надежностью. Доверительные границы средних арифметических показателя S частично совпадают, поэтому считать достоверность их различий можно с надежностью менее 99,7%.

По результатам корреляционного анализа выявлено, что у больных РЛ сохраняется сильная прямая корреляционная связь между показателями С и М (r=0,88).

Предполагая, что изменения показателей ИК-спектроскопии сыворотки крови у больных РЛ связаны с нарушением метаболизма веществ вследствие наличия злокачественной опухоли, мы решили оценить эффективность ИК-спектроскопии для диагностики РЛ. С этой целью были использованы общепринятые и рекомендованные ВОЗ операционные характеристики: чувствительность (Se) и специфичность (Sp). Точка разделения была определена по гисто­граммам распределения признаков каждого из параметров таким образом, чтобы специфичность и чувствительность были относительно одинаковыми. Для параметра Q значение точки разделения было выбрано 1,65, при котором Se=87% и Sp=76%, для R – 0,45 c Se=82% и Sp=100% и для S – 0,85 с Se=85% и Sp 72%. Результаты проведенной статистической обработки показали, что наибольшей информативностью в отношении диагностики РЛ обладает параметр R. Выявлено также, что с довольно высокой вероятностью можно судить о наличии злокачественной опухоли легкого при уменьшении показателя Q ниже 1,65, а показателя S – ниже 0,85. Учитывая, что область спектра поглощения 1160-1065 см-1 является наиболее информативной для дифференциальной диагностики РЛ при исследовании биопсийного материала бронхов и легких [13], а показатель R – это отношение высот пика 1165 к пику 1070, а Q – пика 1070 к Ср, где Ср – среднее значение высот всех определяемых пиков, можно предположить идентичность нарушений молекулярного состава у образцов сыворотки крови и у биопсийного материала легких.

В дальнейшем мы провели интегральную оценку данных ИК-спектроскопии, принимая во внимание выявленные в процессе исследования наиболее информативные параметры спектрограммы для диагностики РЛ (R, Q, S). С этой целью был использован логический алгоритм «отыскивания прецедента». В случае наличия у исследуемого двух отрицательных (меньше предложенной точки разделения) признаков, он относился к группе больных, если данных проявлений не было – считался здоровым. Обработку результатов выполняла специально разработанная компьютерная программа. Результаты представлены в виде гистограммы (см. рисунок).

Эффективность ИК-спектроскопии в диагностике РЛ. Интегрированная оценка параметров R, Q, S: NH - истинно отрицательные; PH - ложно положительные; PS - истинно положительные; NS - ложно отрицательные

Совместное использование параметров R, Q, S для диагностики РЛ методом ИК-спектроскопии повышает его чувствительность до 85% при относительно высокой специфичности – 87%.

Распространенность опухолевого процесса является одним из ведущих факторов, определяющих выбор метода лечения, объем оперативного вмешательства и прогноз. Исследуемые больные РЛ были разделены на две группы. В первую вошли пациенты с I-II стадией заболевания (28 человек), а во вторую – с III-IV стадией (43 человека). У каждой из групп проведена статистическая обработка данных ИК-спектроскопических параметров. Достоверной разницы между ними не обнаружено. Учитывая, что метод ИК-спектроскопии основан на регистрации собственных колебаний атомов в системе химической структуры веществ крови, без их индивидуального количественного анализа, по результатам проведенного исследования можно сделать вывод о появлении в сыворотке крови больных РЛ нарушений баланса веществ, специфичных для данной патологии, не изменяющихся химически в зависимости от стадии заболевания.

Предполагая, что изменения показателей ИК-спектроскопии сыворотки крови у больных РЛ связаны с нарушением метаболизма веществ вследствие наличия злокачественной опухоли, мы решили оценить эффективность ИК-спектроскопии для диагностики РЛ. С этой целью были использованы общепринятые и рекомендованные ВОЗ операционные характеристики: чувствительность (Se) и специфичность (Sp). Точка разделения была определена по гисто­граммам распределения признаков каждого из параметров таким образом, чтобы специфичность и чувствительность были относительно одинаковыми. Для параметра Q значение точки разделения было выбрано 1,65, при котором Se=87% и Sp=76%, для R – 0,45 c Se=82% и Sp=100% и для S – 0,85

Термин «рак легкого» объединяет различные по морфогенезу, клиническим проявлениям, прогнозу и результатам лечения злокачественные эпителиальные опухоли. В настоящее время общепринято подразделять многообразные гистологические виды этого рака на две основные формы: мелкоклеточный и немелкоклеточный. В нашей работе в связи с малым количеством случаев мелкоклеточного рака мы провели сравнительный анализ данных ИК-спектроскопических параметров для групп больных с плоскоклеточным раком (54) и аденокарциномой (15). Достоверно различались параметры М (p < 0,01) и MMAL (p < 0,02). Причем для плоскоклеточного рака было характерно большее значение параметра М и меньшее значение – MMAL, что на спектрограммах проявлялось большой разницей высот минимального и максимального пиков. Такие большие различия в высоте определяемых пиков для больных аденокарциномой были нехарактерны. Достоверных различий показателей R, Q, S в этих группах не установлено.

Таким образом, по нашим данным, специфические нарушения химической структуры сыворотки крови, фиксирующиеся ИК-спектроскопическими показателями R, Q и S, характерны для РЛ вне зависимости от гистологической структуры опухоли, степени распространенности процесса, а учитывая, что чувствительность и специфичность метода исследования не зависят от количественного соотношения веществ крови, можно считать возможным использование ИКспектроскопии для выявления рака легкого, в том числе и на ранних стадиях.

Литература

1. Мирабишвили В.М., Дятченко О.Т. Статистика рака легкого (заболеваемость, смертность, выживаемость). Практ онкол 2000; 3: 3-7.

2. Трапезников Н.Н. Злокачественные новообразования в СССР и союзных республиках. М: Медицина; 1989; с. 278-312.

3. Eckersberger F. Bronchialkarcinom. Wien Med Wochensch 1994; 144: 545-547.

4. Wingo P.A., Tong T., Bolden S. Cancer statistics, 1995. CA Cancer J Clin. 1995; 45:8-30.

5. Барчук А.С., Вагнер Р.И., Лемехов В.Г. и др. Современные подходы к диагностике и лечению рака легкого. Вопр онкол 1997; 1: 15-21.

6. Чучалин А.Г. Пульмонология в России и пути ее развития. Пульмонология 1998; 4: 2-6.

7. Седых С.А. Современные аспекты лучевой диагностики периферического рака легкого. Российский онкологический журнал 1998; 4: 58-61.

8. Бакулин М.П., Потапова И.А. Рак легкого: сложности диагностики. Роль и значение иммунологических методов. Медицинская консультация 1995; 3: 37-40.

9. Бахлаев И.Е., Олейник Е.К., Олейник В.М. и др. Сравнительный анализ иммунологических методов исследования в скрининге, диагностике и мониторинге рака легкого. Онкология 2000; 1-2: 60-63.

10. Слугарев В.В. Сонолюминесцентный метод в комплексной диагностике рака легкого на догоспитальном этапе. Дис. ... канд. мед. наук. Н.Новгород; 1999.

11. Вилков Л.В., Пентин Ю.А. Физические методы исследования в химии. М: Высшая школа; 1987; с.244-245.

12. Поляков И.В., Соколова Н.С. Практическое пособие по медицинской статистике. М: Медицина; 1975;с. 152.

13. Кукош В.И., Гордецов А.С., Скобелева С.Е. и др. Способ подготовки биоптата для регистрации инфракрасных спектров при диагностике рака легкого. А.с. №1803990. 1989.