Н.Н. Андреева, Т.И. Соловьева, И.В. Мухина, Р.Д. Лапшин

Нижегородская государственная медицинская академия; ЦНИЛ, Нижний Новгород

Физико-химическая характеристика мембран клеток при различных моделях клинической смерти у крыс

Ведущим фактором в патогенезе критических состояний является гипоксия. Возникая в организме при неадекватном снабжении тканей и органов кислородом, она приводит к подавлению аэробного синтеза энергии, энергозависимых функций и метаболизма клеток [1] и, в частности, к комплексной модификации функций биологических мембран [2]. Тяжесть и обратимость ишемических и реперфузионных повреждений органов зависят от полноты нарушений кровообращения, сохранения оттока метаболитов из органа [3,4].

Для изучения структурных и метаболических изменений в ишемизированных органах при клинической смерти наиболее адекватной является модель тотальной ишемии. Эта модель позволяет прекратить доставку в орган кислорода и субстратов окисления, предотвратить отток метаболитов, т.е. полностью воспроизвести весь комплекс отрицательных воздействий, обусловливающих тяжесть ишемии и влияющих на механизмы ишемических повреждений, а также создать одинаковые условия в разных органах, выявить органные различия в нарушении мембран [3]. В экспериментальных исследованиях для создания ситуации, эквивалентной клинической смерти, полную ишемию моделируют путем острой кровопотери [4] или пережатия сердечно-сосудистого пучка [5].

В литературе имеются сведения о нарушении липидного обмена в органах при гипоксических состояниях, воспроизведенных на различных моделях [6—8], однако практически отсутствуют данные об изменении физико-химической характеристики мембран клеток разных органов при клинической смерти.

Цель исследования — сопоставить изменения фосфолипидного компонента мембран клеток мозга, сердца и печени при клинической смерти, смоделированной путем пережатия сердечно-сосудистого пучка и острой кровопотери.

Материалы и методы. Эксперименты выполнены на белых нелинейных крысах-самцах (массой 180—220 г), содержащихся на стандартном рационе вивария. Клиническую смерть моделировали путем острой кровопотери (n=12) и пережатия сердечно-сосудистого пучка (n=8).

В первом случае у наркотизированных нембуталом животных (35 мг/кг) производили трахеостомию и катетеризировали общую сонную артерию. Через катетер выпускали максимально возможное количество крови до исчезновения самостоятельного дыхания и отсутствия давления в сонной артерии, что и считалось началом клинической смерти. Через 5 мин после ее наступления осуществляли забор мозга, сердца и печени для биохимических исследований.

Во втором случае для наркоза использовали нембутал (25 мг/кг) и эфир. Через некоторое время производили интубацию трахеи, а затем полное пережатие сосудистого пучка сердца Г-образным крючком внутриторакально без вскрытия грудной клетки и пневмоторакса. Через 3—4 мин крючок извлекали из грудной клетки, и животное в течение еще 5 мин находилось в состоянии клинической смерти. Затем осуществляли забор органов для биохимического анализа.

Контролем служили интактные животные (n=13).

Липиды экстрагировали по Folch [9]. Разделение их на фракции проводили методом тонкослойной хроматографии [10]. Количественную оценку фракций фосфолипидов и нейтральных липидов осуществляли на сканере Scan Maker E6 фирмы «Microtek» с использованием программы «SigmaGel». Содержание отдельных классов липидов выражали в процентах от суммы площадей пиков, принятой за 100% [11].

Об активности процесса перекисного окисления липидов (пол) судили по накоплению молекулярных продуктов пероксидации [12, 13]. Состояние антиоксидантной защиты клеток оценивали по активности ферментов СОД (супероксиддисмутазы) и каталазы [14, 15]. Статистическую достоверность различий оценивали методом Стьюдента. Различие считали достоверным при р=0,05.

Результаты и обсуждение. При клинической смерти как в результате полного пережатия сердечно-сосудистого пучка, так и при острой кровопотере во всех исследуемых органах по сравнению с интактной серией наблюдались изменения в спектральном составе фосфолипидов и нейтральных липидов. Однако степень их выраженности в мозге, сердце и печени была неоднозначной и отличалась в зависимости от опытной модели.

При клинической смерти путем острой кровопотери по сравнению с контролем наиболее изменился фракционный состав липидов мозга: уменьшилось содержание доминантных мембранных фосфолипидов — фосфатидилэтаноламина (ФЭ) и фосфатидилхолина (ФХ) — в среднем на 21,5%, отсутствовал фосфатидилсерин (ФС), содержание которого у интактных животных составило 5,6% (рис. 1).

Рис. 1. Спектр фосфолипидов (а) и фракционный состав нейтральных липидов (б) мозга при клинической смерти; * — достоверность различий с интактной серией, рш0,05; • — достоверность различий между опытными сериями, рш0,05

Параллельно в мозге отмечалось накопление лизоформ ФЭ и ФС (ЛФЭ и ЛФС), фракций фосфатидных кислот (ФК), диацилглицеридов (ДГ) и увеличение свободных жирных кислот (СЖК) на 79%, уменьшение холестерина (ХС) и триацилглицеридов (ТГ) на 34 и 57% соответственно.

Известно, что ФК являются промежуточными, а ДГ — конечными соединениями в синтезе фосфолипидов и триацилглицеридов [16], и деградация липидного бислоя мембран при ишемии сопровождается накоплением лизоформ фосфолипидов и СЖК [2,3,7]. Следовательно, полученные изменения спектрального состава липидов мозга при острой кровопотере свидетельствуют о нарушении динамического равновесия процессов деацилирования/реацилирования, увеличении активности фосфолипаз, угнетении синтеза фосфолипидов de novo и соответственно о повреждении системы репарации мембранных структур клеток мозга. В то же время уменьшения содержания ХС и лизофосфатидилхолина (ЛФХ) на 72,5% в ткани мозга, по-видимому, являются компенсаторными реакциями клетки, направленными на уменьшение микровязкости липидного бислоя мембран, так как ХС обусловливает конденсирующий эффект фосфолипидов [16], и на уменьшение детергентного действия на мембраны лизофосфатидов [3]. В мозге наблюдалось падение активности антиоксидантных ферментов СОД и каталазы в 4 и 2,9 раза соответственно.

Спектр липидов сердца при клинической смерти, вызванной острой кровопотерей, по сравнению с контролем претерпевал меньшие изменения, чем состав липидов мозга. В частности, в кардиомиоцитах содержание ФХ уменьшилось незначительно (на 10%), из лизоформ наблюдалось увеличение только ЛФХ на 66%, при этом отмечалось повышение сфингомиелина (СМ) в 2,2 раза, ФС — на 57%, эфиров холестерина (ЭХС) — на 27% и снижение количества ХС на 17% (рис. 2).

Рис. 2. Спектр фосфолипидов (а) и фракционный состав нейтральных липидов (б) сердца при клинической смерти; * – достоверность различий с интактной серией, рш0,05; • – достоверность различий между опытными сериями, рш0,05

Значительное повышение ЛФХ в ткани сердца имеет отрицательное значение, так как лизофосфатиды повреждают сарколеммальную мембрану, вызывают в кардиомиоцитах накопление Са2+ и одновременно приводят к нарушению биоэлектрической активности мембран ишемического миокарда [7].

Увеличение относительно количества ФС в фосфолипидном спектре кардиомиоцитов, возможно, является защитно-приспособительной реакцией и происходит за счет образования ФС из ФХ и ФЭ путем обменных реакций холина и этаноламина на серин, катализируемых ферментами — холин-специфической фосфатидилсеринсинтетазой и этаноламин-специфической фосфатидилсерин– синтетазой [17].

Учитывая тот факт, что содержание насыщенного СМ и ненасыщенного ФС в фосфолипидном бислое мембран составляет не более 10% от общего содержания фосфолипидов, изменения в соотношении фракций СМ, ФС, ФХ и ХС, очевидно, отражают гомеовязкостную адаптацию мембран клеток миокарда в условиях ишемии.

В ткани сердца в данной серии экспериментов наблюдалось усиление процессов ПОЛ и угнетение антиоксидантной системы, о чем свидетельствуют увеличение количества молекулярных продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов — в 1,35 раза и малонового диальдегида — в 4,7 раза) и снижение активности СОД на 25%.

Фракционный состав фосфолипидов и нейтральных липидов ткани печени в период клинической смерти в результате острой кровопотери по сравнению с интактной серией практически не изменился, за исключением небольшого повышения содержания ФХ — на 15% и отсутствия фракции фосфатидных кислот (рис. 3).

Рис. 3. Спектр фосфолипидов (а) и фракционный состав нейтральных липидов (б) печени при клинической смерти; * – достоверность различий с интактной серией, рш0,05; • – достоверность различий между опытными сериями, рш0,05

По мнению авторов [3,18], ФХ обладает антиоксидантными свойствами и увеличение его количества в липидном бислое мембран повышает их резистентность к ПОЛ.

В серии с моделированием клинической смерти путем пережатия сердечно-сосудистого пучка наблюдалась более выраженная делипидизация мембран клеток ишемизированных органов.

Содержание доминантных мембранных фосфолипидов ФХ и ФЭ уменьшилось по сравнению с контролем в мозге, сердце и печени: ФХ — в среднем на 24% в ткани каждого органа, ФЭ — в сердце на 22%, а в мозге и печени в среднем на 43% в каждом (см. рис.1, 2, 3). В гепатоцитах фосфатидилсериновая фракция отсутствовала, а в клетках мозга ее количество уменьшилось на 36% по сравнению с интактной серией. Во всех органах отмечалось накопление лизофосфатидов: ЛФС, ЛФЭ — в мозге и печени; ЛФЭ — в сердце и увеличение ЛФХ в печени в 3 раза. Параллельно регистрировали повышение содержания СЖК в тканях мозга в 2,6 раза и печени — на 63%. В мозге отмечалось снижение активности СОД и каталазы в 3,5 и 2,9 раза соответственно. Полученные данные свидетельствуют об активации двух процессов: фосфолиполиза и ПОЛ [8, 19]. Известно, что увеличение содержания лизоформ фосфолипидов и СЖК в ишемизированных органах оказывает детергентное действие на мембранный аппарат клеток и вызывает нарушение активности липидзависимых мембранных ферментов, обеспечивающих метаболические, транспортные, регуляторные и рецепторные функции [3, 7].

При моделировании клинической смерти путем пережатия сердечно-сосудистого пучка в органах усиливается не только фосфолиполиз, но и гидролиз нейтральных липидов. так, содержание ЭХС уменьшилось в мозге на 81%, в печени — на 50%, ТГ в мозге — на 23%.

Нарушение энергетического статуса клетки при ишемии в результате инактивации энергообразующих процессов [1, 2] приводит к ингибированию синтеза фосфолипидов de novo, о чем свидетельствует накопление ФК в мозге и увеличение этой фракции в сердце в 2,9 раза. Эти изменения сопровождаются повреждением репарации липидного бислоя мембран, так как согласно полученным данным происходит некомпенсируемое уменьшение основных фосфолипидов в клетках разных органов.

Увеличение содержания ХС на 34%, СМ в сердце и печени — в 2 и 3,6 раза соответственно на фоне снижения количества ненасыщенных фосфолипидов ФЭ и ФС будет способствовать повышению микровязкости липидного компонента мембран, так как неэстерифицированный ХС оказывает конденсирующий эффект на фосфолипиды и в СМ преобладают насыщенные жирные кислоты [16,18]. Повышение содержания СМ в составе липидного бислоя можно рассматривать как защитную реакцию клетки в ответ на активацию ПОЛ в связи с тем, что СМ — фосфолипид, наиболее устойчивый к пероксидации [16]. По-видимому, снижение содержания ХС на 23% и ЛФХ на 81% в мозге также можно оценить как компенсаторные реакции, направленные на регуляцию микровязкости мембран и уменьшение повреждающего действия лизофосфатидов.

Обращает на себя внимание тот факт, что при клинической смерти, моделированной пережатием сердечно-сосудистого пучка по сравнению с интактной серией в кардиомиоцитах значительно снизилось содержание СЖК — на 71%. Уменьшение его количества в липидном спектре миокарда, возможно, обусловлено следующими причинами: включением СЖК в ТГ (содержание ТГ увеличилось на 27%), так как активация синтеза ТГ при аноксии и ишемии доказана экспериментами на изолированных сердцах [19]; участием СЖК в реакциях ПОЛ и возможно в b-окислении. Последнее предположение представляется весьма спорным, но мы основываемся на том, что при пережатии сердечно-сосудистого пучка первые секунды наблюдается сокращение сердечной мышцы, обусловленное таким её свойством, как автоматия, и благодаря наличию остаточного кислорода в крови.

Сравнительный анализ липидного спектра тканей исследуемых органов после клинической смерти, выполненной на разных моделях, показал, что при пережатии сердечно-сосудистого пучка по сравнению с острой кровопотерей изменения в соотношении основных мембранных фосфолипидов ФХ и ФЭ имели однонаправленный характер, но более выраженный. Так, потеря в мозге ФЭ была выше на 25%, в сердце ФХ и ФЭ — в среднем на 19% каждой фракции, а печени уменьшение ФЭ было значительно выше уменьшения ФХ (на 51 и 32% соответственно). Во всех ишемизированных органах при сравнении двух опытных серий наблюдали накопление лизофосфатидов, при этом количество ЛФС в мозге увеличилось значительно больше и регистрировали наличие ЛФЭ в сердце при пережатии сердечно-сосудистого пучка. Участие лизофосфолипаз на втором этапе гидролиза фосфолипидов в большей степени проявляется в мозге и сердце также при этой модели: количество ЛФЭ в мозге уменьшилось на 20%, ЛФХ — на 32%, в сердце ЛФХ — на 26%.

Отличительной особенностью модификации липидного спектра при пережатии сердечно-сосудистого пучка являются более значительные изменения состава фосфолипидов в печени по сравнению с другими органами. Так, в печени наблюдалось накопление ЛФЭ, ЛФС и ФК, содержание ЛФХ увеличилось в 5 раз, отсутствовал ФС. Учитывая существенное падение содержания ФХ, ФЭ, повышение количества лизофосфатидов и ФК, а также СЖК (на 63%), можно заключить, что при пережатии сердечно-сосудистого пучка по сравнению с острой кровопотерей в клетках печени происходит более значительное повреждение липидного бислоя мембран и ингибирование синтеза фосфолипидов de novo. Эти изменения могут иметь существенное значение для восстановительного периода, так как в отличие от мозга и сердца синтез фосфолипидов в печени направлен не только на поддержание структуры и функции клеточных мембран, но и на обеспечение потребностей в фосфолипидах клеток других органов [16, 20]. Увеличение количества СМ в гепатоцитах в 3 раза в опытной серии с пережатием сердечно-сосудистого пучка, по сравнению с другой серией, является компенсаторной реакцией, направленной на повышение резистентности мембран гепатоцитов к ПОЛ. Следует отметить и такие изменения липидного спектра мозга и сердца при пережатии сердечно-сосудистого пучка, по сравнению с острой кровопотерей, как наличие ФС в мозге, разнонаправленное изменение содержания СЖК в мозге и сердце (в мозге СЖК увеличилось на 44%, в сердце снизилось на 73%), значительное повышение холестерина (на 62%) в сердце. Увеличение содержания ФС в мозге, по-видимому, происходит за счет обменных реакций между фосфолипидами [16], в то же время в работе [20] приведены сведения, доказывающие возможность обеспечения некоторых энергетических потребностей синтеза фосфолипидов в мозговых препаратах анаэробными гликолитическими реакциями.

Заключение. Анализ результатов наших исследований позволяет сделать вывод о наличии общих закономерностей в модификации фосфолипидного компонента мембран клеток мозга, сердца и печени при клинической смерти, выполненной на разных моделях: фактически некомпенсируемое снижение доминантных мембранных фосфолипидов (ФЭ и ФХ) и ненасыщенного ФС в результате активации фосфолиполиза, ПОЛ и ингибирования синтеза фосфолипидов de novo; накопление продуктов гидролиза липидов (СЖК и лизофосфатидов), оказывающих детергентное действие на мембраны; повышение микровязкости липидного компонента мембран как следствие изменения соотношения индивидуальных фосфолипидов. В то же время следует подчеркнуть, что эти изменения при острой кровопотере более существенны в мозге, чем в сердце, и незначительны в печени; при полном пережатии сердечно-сосудистого пучка степень их выраженности гораздо выше во всех исследуемых органах, и особенно в мозге и печени. Возможно, при пережатии сердечно-сосудистого пучка большее кровенаполнение органов в сочетании с отсутствием оттока метаболитов оказывает гораздо более сильное отрицательное воздействие на клеточный метаболизм.

Отличительными особенностями изменений ишемизированных органов при пережатии сердечно-сосудистого пучка по сравнению с моделью острой кровопотери являются: повышение активности лизофосфолипаз не только в мозге, но и в сердце; увеличение микровязкости фосфолипидного компонента гепатоцитов и кардиомиоцитов в результате значительного повышения СМ в печени и ХС в сердце; ингибирование синтеза фосфолипидов в печени (уменьшение содержания ФХ и ФЭ регистрировали только при клинической смерти путем пережатия сердечно-сосудистого пучка и отсутствие фракции ФК — при острой кровопотере).

Литература

1. Лукьянова Л.Д. Современные проблемы гипоксии. Вестник РАМН, 2000; 9; 3—11.
2. Оковитый С.В., Смирнов А.В. Антигипоксанты. Экспериментальная и клиническая фармакология 2001; 64 (3): 76—80.
3. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов. М: Медицина; 1989; 368 с.
4. Неговский В.А., Гурвич А.М., Золотокрылина Е.С. Постреанимационная болезнь. М: Медицина;1987; 480 с.
5. Корпачев В.Г., Лысенков С.П., Тель Л.З. Моделирование клинической смерти и постреанимационной болезни у крыс. Патол физиология и эксперим терапия 1994; 5: 44—48.
6. Заржецкий Ю.В., Мутускина Е.А. и др. Влияние сукцината натрия на функциональные, биохимические и морфологические показатели восстановления ЦНС у крыс после 10 мин остановки кровообращения. Анестезиология и реанимация 1994; 5: 44—48.
7. Литвицкий П.Ф. Патогенные и адаптивные изменения в сердце при его региональной ишемии и последующем возобновлении кровотока. Патол физиология и эксперим терапия 2002; 2: 2—12.
8. Хачатурьян М.Л., Гукасов В.М., Комаров П.Г. и др. Сравнительная оценка показателей ПОЛ сердца, печени и мозга крыс с различной устойчивостью к гипоксии. Бюлл экспер биол и медицины 1996; 2: 138—143.
9. Folch J., Lees M., Stanley G. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. Biol Chem. 1957; 226 (2): 497—509.
10. Шаршунова М., Шварц В., Михалец Ч. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии. Т. 2. М: Мир; 1980.
11. Пецев Н., Коцев Н. Справочник по газовой хроматографии. М: Мир; 1987.
12. Smith J.B., Ingerman C.M., Silver M.J. Malondialdehyde formation as an indication of prostaglandin production by human pletelets. Lab Clin Med 1976; 88 (1): 167—172.
13. Fletcher D.L., Dillared C.J., Tappel A.Y. Measurement of fluorescent lipid peroxidation products in biological system and tissues. Analyt Biochem 1973; 52: 497—499.
14. Aebi H. Methoden der erymatiechen analyses. Biochemistry 1970; 2: 636—647.
15. Nishikimi M., Rao A., Xagi K. The accurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenaxine metasulfate and molecular oxygen. Biochem Biophys Res Commun 1972; 146 (2): 849—854.
16. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения. СПб: Питер; 1999; 505 с.
17. Vance D.E. Glycerolipid biosynthesis in eukaryotes. In: Vance D.E., Vance J.E. eds Biochemistry of Lipids, Lipoprotein and Membranes. Amsterdam: Elsevier; 1996; p. 153—180.
18. Бурлакова Е.Б. Роль липидов в процессе передачи информации в клетке. В кн.: Биохимия липидов и их роль в обмене веществ. Под ред. акад. С.Е. Северина, М: Наука; 1981; с. 23—34.
19. Демуров Е.А., Игнатова В.А. Метаболические и нейрогуморальные механизмы ишемических повреждений миокарда. М: ВИНИТИ; 1985.
20. Четвериков Д.А., Райзе Т.Е., Шарагина Л.М. Содержание, обмен и метаболические взаимоотношения фосфолипидов субклеточных фракций головного мозга крыс. В кн.: Биохимия липидов и их роль в обмене веществ. М: Наука; 1981; с. 155—166.