А.А. Миронов, И.В. Мухина, В.Н. Крылов, Л.Б. Снопова, Н.В. Жемарина, Н.Н Проданец

Нижегородская государственная медицинская академия;
Государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород

Влияние превентивного введения буфотина на устойчивость центральной нервной системы крыс к острой гипобарической гипоксии

В последнее время идет интенсивный поиск новых средств и их сочетаний, дополняющих современные возможности интенсивной терапии критических состояний. Среди методов коррекции большой интерес вызывает фармакологическая защита от гипоксии с использованием препаратов природного происхождения, обладающих антигипоксическим эффектом [1—4]. Применение антигипоксантов позволит повысить степень резистентности клеток жизненно важных органов к гипоксии и тем самым снизить число развитий постгипоксических энцефалопатий и сердечно-сосудистой недостаточности.

Одним из таких средств является разра­ботанный в ННГУ (патент № 2068697 от 10.11.1996 г.) и разрешенный ФК МЗ РФ для клинического изучения кардиотонический препарат на основе яда жаб — буфотин (от латин­ского родового названия жаб — «буфо» и окончания — «ин», определяющего, согласно рекомендациям ФК МЗ РФ, принадлежность к кардиотоническим средствам). Он представляет собой инъекционный 0,1% водно-спиртовой раствор экстракта кожных желез (жабьего яда) жабы зеленой (Bufo viridis Laur). По данным доклинического изучения, проведенного в ННГУ и НГМА, препарат имеет преимущество перед катехоламинами по продолжительности кардиостимулирующего и вазотонического действий, по отсутствию выраженного хронотропного действия, а перед сердечными гликозидами — по быстроте наступления указанных эффектов.

К другим преимуществам буфотина относится его способность уменьшать негативные побочные эффекты в постреанимационном и послеоперационном периодах. На моделях угрожающих состояний организму крыс, кошек, собак (инфаркт миокарда, остановка сердца, геморрагический шок и др.) выявлено протекторное действие препарата на миокард при одновременном повышении его функциональной активности, что позволяет снять такие отрицательные эффекты реанимации, как аритмии сердца, нарушения ультраструктуры кардиомиоцитов. Ранее проведенные исследования выявили у буфотина не только кардиотропные, но и антиоксидантные свойства [5,6]. В то же время остается практически не изученным его действие на ЦНС и ее высшие интегративные функции.

Цель исследования — изучение механизмов влияния препарата жабьего яда буфотина на устойчивость высших отделов ЦНС крыс к гипоксии. Решались следующие задачи:

1) влияние буфотина на высшие интегративные функции ЦНС интактных животных: поведение, обучение, память;

2) характер влияния острой гипобарической гипоксии на поведение экспериментальных животных;

3) оценка нейропротекторного действия буфотина на восстановление функционального состояния высших отделов ЦНС в постгипоксическом периоде.

Материалы и методы. Эксперименты были проведены на 110 белых лабораторных крысах-самцах линии Вистар массой 180—220 г, содержащихся на стандартном рационе вивария. Поведение животных исследовалось с помощью теста «открытое поле» [7] и многопараметрового метода оценки тревожно-фобических состояний [8].

Установка «открытое поле» представляет собой круглую камеру диаметром 120 см с металлическими стенками высотой 28 см. Пол изготовлен из белого пластика, на нем черной краской нанесена решетка, делящая его на 25 квадратов со стороной 20 см. Лампы накаливания (6 ламп по 60 Вт) располагаются по кругу диаметром 60 см на высоте 80 см от поверхности поля. Освещенность площадки во время опыта — 200 лк. Животное помещается в центральный квадрат и за ним ведется наблюдение. Визуально подсчитывается количество отдельных поведенческих актов [9]. С целью определения ориентировочно-исследовательской активности животных в «открытом поле» регистрировались следующие показатели их поведенческой активности: горизонтальная двигательная активность (число пересеченных квадратов в «открытом поле»); вертикальная двигательная активность (число стоек — подъемов на задние лапы).

В основу многопараметрового метода комплексной оценки тревожно-фобических состояний у крыс положены две ситуации, связанные с проявлением тревоги и страха у животных: 1) столкновение с незнакомым неживым объектом или незнакомой ситуацией (тесты I—V) и 2) действие руки экспериментатора (тесты VI—IX). Порядок следования тестов всегда одинаков: от I к IX. Для всех тестов, входящих в состав шкалы для оценки (в баллах) тревожно-фобического уровня у крыс, установлены единые пределы изменения выраженности ответной реакции: от 0 до 3 баллов. Бульшая оценка в баллах соответствовала более выраженной ответной реакции у животного, и, следовательно, более высокому тревожно-фобическому уровню. Для характеристики тревожно-фобического состояния в целом использовался показатель суммы баллов по результатам полного обследования. По окончании каждого теста использованное оборудование подвергали дезодорации.

Для моделирования острой гипобарической гипоксии используется вакуумная проточная барокамера при внешней температуре 20—22оС [10]. Крысы помещаются в условия, соответствующие подъему на высоту 11500—12 000 м со скоростью 183 м/с. О степени резистентности к гипоксии судят по времени выживания «на высоте» до появления второго агонального вдоха. Низкоустойчивыми (НУ) к гипоксии считаются животные со значением этого показателя не выше 3 мин, высокоустойчивыми (ВУ) — выше 10 мин, среднеустойчивыми (СУ) — с промежуточным значением.

Светооптическая микроскопия проводилась на гистологических препаратах коры головного мозга крыс, приготовленных после 72—96 ч фиксации в 10%-ном забуференном водном растворе нейтрального формалина. Материал заключали в парафин. Приготовленные срезы мозга толщиной 7 мкм окрашивались гематоксилин-эозином и крезиловым фиолетовым по Нисслю [12]. Буфотин вводили внутрибрюшинно в дозе 0,1 мг/кг за 15 мин до проведения каждого конкретного эксперимента. Полученные данные были обработаны на компьютере IBC PC / АТ с помощью программы Microsoft Exсel. Достоверность различий средних определяли по t-критерию Стьюдента. Различия считали достоверными при уровне значимости р < 0,05.

Результаты и обсуждение. В связи с предположением о наличии у препарата антигипоксических свойств было интересным изучить его влияние на резистентность животных к острой гипоксии. С этой целью проведены эксперименты по исследованию действия превентивного введения буфотина на выживаемость крыс при создании острой гипобарической гипоксии и восстановление поведенческих реакций в тесте «открытое поле», снижение уровня тревожности после гипоксии.

В контрольной серии по изучению устойчивости к гипоксии получено следующее соотношение: больше половины составили НУ животные (58,3%), 29,2% — СУ животные и лишь 12,5% составили ВУ животные. Общая смертность в контрольной серии составила 41,66%, в основном за счет низко– и среднеустойчивых к гипоксии.

В группе НУ погибли 42,8% животных, в группе СУ — 57,1%. Среди ВУ-животных смертность равнялась нулю, что связано с более высокой активностью некоторых окислительных ферментов, способных в короткие сроки реагировать на экстремальные условия. У средне– и низкоустойчивых животных ферментные системы, обладая меньшей лабильностью, не успевают перестраиваться на более экономичный путь использования кислорода в условиях острой гипоксии [13].

В наших экспериментах соотношение различных по устойчивости к гипоксии групп среди высоко– и низкотревожных животных в контрольной серии было следующим. Среди низкотревожных животных: ВУ — 22%, СУ — 33%, НУ — 44%, т. е. преобладали СУ и ВУ животные, в группе высокотревожных животных НУ составили 66,6%, в то время как СУ и ВУ — 26,7 и 6,7% соответственно.

Изменение уровня тревожности и общей двигательной активности в контрольной серии в пост­гипоксическом периоде показано на рис. 1.

Рис. 1. Динамика изменения уровня тревожности и двигательной активности крыс в постгипоксическом периоде в контрольной серии. Здесь и далее: ВТ — высокотревожные животные; Вав — с высокой вертикальной активностью; Ваг — с высокой горизонтальной активностью. * — различие показателей по сравнению с исходным периодом, р<0,05

Уровень тревожности в 1-е сутки после гипоксии достоверно не повышался, в то время как общая двигательная активность существенно уменьшалась, что является отражением пассивно-оборонительной тактики поведения крысы в ответ на гипоксический стресс.

На 7-е сутки наблюдалось общее повышение уровня тревожности по сравнению с исходными показателями, что, вероятно, свидетельствует в пользу пассивно-оборонительной мотивации поведения на протяжении первых семи суток после гипоксии. Некоторая дискоординация между этими показателями должно быть происходила вследствие нарушения функционально-анатомических связей как между отдельными нейронами, так и различными отделами мозга. Несмотря на то, что вертикальная активность несколько увеличивалась, общая ориентировочно-исследовательская активность оставалась на очень низком уровне по сравнению с исходным.

Аналогичную картину наблюдали и на 14-е сутки: хотя тенденция к снижению уровня тревожности уже начинала проявляться, общая двигательная активность оставалась на том же уровне. На 21-е сутки уровень тревожности снижался до исходного, а ориентировочно-исследователь­ская активность начинала возрастать. К 28-м суткам постгипоксического периода уровень тревожности восстанавливался до исходного, общая двигательная активность не достигала и половины исходного уровня, хотя, начиная с 14 сут возрастала, достоверно стремясь к исходному уровню.

Таким образом, среди крыс линии Вистар преобладают НУ и СУ животные. Высокотревожные крысы встречаются преимущественно среди низкоустойчивых. В постгипоксическом периоде достаточно долго не происходит восстановления исходного уровня поведенческой активности животных. Отмечается развитие ярковыраженной пассивно-оборонительной мотивации в поведении крыс в ответ на воздействие острой гипобарической гипоксии.

Параллельно изучению изменения поведенческих реакций в постгипоксическом периоде на протяжении всего эксперимента исследовалось в динамике поведение интактных крыс (рис. 2)

Рис. 2. Динамика изменения уровня тревожности и двигательной активности крыс в интактной серии на протяжении 28 суток. * — различие показателей по сравнению с исходным периодом, р<0,05

в связи с необходимостью учета развития реакции привыкания с каждой последующей процедурой тестирования животных. Установлено, что с течением времени и последовательности тестирования снижались уровень тревожности, горизонтальная и вертикальная активность в группе высокоактивных животных. В группе низкоактивных животных отмечалось снижение горизонтальной активности. В результате в популяции уменьшалось количество высокотревожных животных, а количество высокоактивных крыс колебалось в пределах исходных величин.

В серии с превентивным введением буфотина СУ животных было на 30% меньше, чем в контрольной серии, ВУ — в 2,5 раза больше. Содержание НУ животных не изменялось.

Смертность составила всего 10% по сравнению с 41,6% в контроле. В группах НУ и СУ животных она равнялась нулю, в то время как у ВУ животных составила 33%. Коэффициент защиты буфотина (эффективность антигипоксических свойств) составил 0,68, что ставит его по проявлению антигипоксических свойств в один ряд с такими препаратами, как амтизол [3].

Среди низкотревожных животных отсутствовали СУ животные, НУ и ВУ животных было поровну. Среди высокотревожных животных НУ было 50%, что ниже конрольного на 16%, СУ — 13%, что ниже контрольного (27%) в два раза. За счет этого увеличилась до 37% группа ВУ, что превысило аналогичный показатель в контроле (7%) более чем в пять раз. Таким образом, буфотин увеличивал резистентность крыс к гипоксии, особенно в «группе риска» — среди высокотревожных животных, значительно снижая, по сравнению с контролем, общую смертность.

Изменение уровня тревожности и общей двигательной активности в постгипоксическом периоде в серии с буфотином происходило следующим образом (рис. 3).

Рис. 3. Динамика изменения уровня тревожности и двигательной активности крыс в постгипоксическом периоде в серии с введением буфотина. * — различие показателей по сравнению с исходным периодом, р<0,05

В 1-е сутки после гипоксии наблюдалось достоверное снижение уровня тревожности по сравнению с исходным. Вертикальная активность также снижалась почти в три раза по сравнению с исходной, в то время как горизонтальная активность оставалась на уровне исходной, что объясняется наступившими в результате гипоксического стресса функциональными нарушениями ЦНС, приведшими к дисбалансу между ориентировочно-исследовательской активностью и уровнем тревожности.

На 7-е сутки отмечалось повышение уровня тревожности, однако он по-прежнему был ниже исходного в отличие от контрольной серии. Вертикальная активность увеличивалась в два раза по сравнению с 1-ми сутками, приближаясь к исходному уровню, горизонтальная достоверно снижалась аналогично контрольному показателю в это же время.

К 14-м суткам уровень тревожности оставался примерно на том же уровне, вертикальная активность достигала исходной величины, горизонтальная оставалась сниженной. На 21-е сутки наблюдалось восстановление уровня тревожности, вертикальной активности до исходного значения, горизонтальная активность оставалась на прежнем уровне. На 28-е сутки уровень тревожности, показатели общей двигательной активности не отличались от исходных, в отличие от контроля, где уровень тревожности достигал исходного, а показатели общей двигательной активности оставались сниженными.

Таким образом, профилактическое введение буфотина перед созданием условий острой гипобарической гипоксии снижало смертность среди крыс, повышало устойчивость их к гипоксии, способствовало более быстрому, по сравнению с контролем, восстановлению исходного уровня тревожности и общей двигательной активности в постгипоксическом периоде.

Следует отметить, что, сравнительное изучение влияния буфотина и ряда препаратов с антигипоксическим действием, исследованных нами ранее (амтизол, актовегин, озонированный физиологический раствор, цитохром С) [3, 14] показало более быстрое восстановление исходного уровня общей двигательной активности и тревожности после его применения.

Положительное влияние превентивного введения буфотина подтверждалось при изучении гистологических препаратов коры головного мозга животных.

По сравнению с интактной серией (рис. 4, а, б)

Рис. 4. Структура ткани сенсомоторной зоны коры больших полушарий крыс: а — интактная серия. Окр. гематоксилин-эозином. Ув.: ок. 7, об. 8; б — интактная серия. Окр. по Нисслю. Ув.: ок. 7, об. 40;

в серии с «подъемом контрольных животных на высоту 11500 м» отмечались тотальный периваскулярный и перинейрональный отеки, участ­ки с кровоизлияниями, запустениями микроциркуляторного русла, капилляростазами, характерные для гипоксических изменений [15]. В нейронах наблюдалось набухание ядер, неравномерное распределение тигроида, хроматолиз (рис. 4, в, г).

Рис. 4. Структура ткани сенсомоторной зоны коры больших полушарий крыс: в — серия с «подъемом контрольных животных на высоту 11500 м». Окр. гематоксилин-эозином. Ув.: ок. 7, об. 8; г — серия с «подъемом контрольных животных на высоту 11500 м». Окр. по Нисслю. Ув.: ок. 7, об. 40;

В серии с превентивным введением буфотина перед «подъемом животных на высоту 11500 м» заметно уменьшалось количество и выраженность изменений структуры коры головного мозга. Отмечались участки с незначительными периваскулярным и перинейрональным отеками. Капилляростаз и запустения микроциркуляторного русла практически не обнаруживались. Не наблюдалось также изменений в структуре нейронов, тигроид расположен равномерно (рис. 4, д, е).

Рис. 4. Структура ткани сенсомоторной зоны коры больших полушарий крыс: д — серия с превентивным введением Буфотина перед «подъемом животных на высоту 11500 м». Окр. гематоксилин-эозином. Ув.: ок. 7, об. 8; е — серия с превентивным введением буфотина перед «подъемом животных на высоту 11500 м». Окр. по Нисслю. Ув.: ок. 7, об. 40

В целом гистологическая картина структуры коры головного мозга в данной серии соответствовала таковой в интактной серии.

Неодинаковая чувствительность к гипоксии и стрессу у животных с разными индивидуально-типологическими особенностями может быть связана с различиями в метаболизме биогенных аминов мозга [10,16—19]. Небольшое повышение уровня адреналина и норадреналина приводит к развитию общего адаптационного синдрома при гипоксии, что, в свою очередь, усиливает неспецифическую резистентность клеток и организма в целом [20]. Наиболее вероятно, что в основе обусловленного буфотином повышения устойчивости ЦНС крыс к острой гипобарической гипоксии лежит не один, а несколько механизмов, взаимодополняющих друг друга. Так, буфотин, являющийся стресс-агентом, будучи введенным животным до помещения их в условия острой гипобарической гипоксии, приводил к тому, что они были более готовы к гипоксическому воздействию по сравнению с контрольными животными за счет повышения общей резистентности организма.

Механизм действия буфотина в этом случае, вероятно, определяется свойствами фракций биогенных аминов, входящих в состав препарата — производными 5-гидрокситриптамина (группой буфотенинов), опосредованно влияющих на активацию как моноаминергических, так и эндогенной опиоидной систем головного мозга. Действительно, ранее [21] было показано, что у зоотоксинов, независимо от происхождения, существует четко выраженная способность активировать эндогенную опиоидную систему.

Экзогенное воздействие моноаминов в составе буфотина на высшую нервную деятельность, связано, по всей видимости, с их опосредованным действием на ЦНС через вегетативные функции организма, так как показано, что адреналин и норадреналин не проходят через гемато-энцефалический барьер (за исключением гипоталамической области) и не способны оказывать непосредственного влияния на ЦНС [1].

Вероятно, что буфотенины активируют норадренергическую и дофаминергическую системы головного мозга, увеличивая в постгипоксическом периоде количество животных с активным типом поведения в «открытом поле» в отличие от контроля [22,23].

Кроме того, буфотин за счет буфадиенолидов — стероидов, производных циклопентанапергид-рофенантрена, имеющих в боковой цепи дважды ненасыщенное шестичленное лактонное кольцо, — обладает антирадикальными свойствами, вызывающими торможение перекисного окисления липидов [5]. Антигипоксическое действие буфотина может быть связано с улучшением доставки кислорода к тканям при критических состояниях. Ранее показано [24,25] выраженное влияние буфотина на увеличение коронарного кровотока, усиление сократительной активности миокарда и внешнего дыхания.

Заключение. Результаты экспериментов убедительно свидетельствуют о возможности повышения резистентности организма животных к острой гипобарической гипоксии с помощью буфотина. Использование его предупреждает гипоксическое нарушение функций высших отделов ЦНС и морфофункционального состояния головного мозга у экспериментальных крыс при моделировании острой гипобарической гипоксии. Превентивное применение препарата оказывает положительное воздействие на восстановление исходного уровня тревожности и общей двигательной активности в постгипоксическом периоде.

Наиболее вероятно, что в основе обусловленного буфотином повышения устойчивости ЦНС крыс к острой гипобарической гипоксии лежит не один, а несколько механизмов, взаимодополняющих друг друга. Так, кардиотонические свойства препарата способствуют улучшению гемодинамики головного мозга животных. Кроме того, антигипоксическое действие буфотина может обеспечиваться торможением свободно-радикальных процессов. оно обусловлено извест­ными антирадикальными свойствами составляющих препарата. Но и в том и в другом случае механизм действия препарата определяется свойствами основных составляющих буфотина: производными 5-гидрокситриптамина — группой буфотенинов и стероидными производными — буфогенинами.

Литература

1. Бояринов Г. А., Мухина И. В., Шапоренко Л. В. Действие цитохрома и буфотина на функциональное состояние миокарда в период реперфузии. В кн.: Антигипоксанты и актопротекторы: итоги и перспективы. СПб; 1994; вып. 1; с. 20.
2. Лукьянова Л.Д. Новое о патофизиологических и патобиохимических механизмах гипоксии. В кн.: Тезисы докладов II Всероссийского конгресса по патофизиологии. М; 2000; с.123.
3. Мухина И.В. Влияние препаратов с антигипоксическими свойствами на функциональное состояние сердца и мозга. Автореф. дис. … докт. биол. наук. М: Изд-во НИИ общей реаниматологии РАМН; 2000.
4. Смирнов А.В., Зарубина И.В., Криворучко Б.И., Миронова О.П. Влияние триметазидина на метаболизм мозга при острой ишемии, осложненной гипоксией. Бюл эксперим биологии и медицины. 2000; 2: 8.
5. Конторщикова К. Н., Мухина И. В., Крылов В. Н. Сравнительное изучение действия гутимина и буфотина на перекисное окисление липидов и сократительную функцию изолированного сердца крыс. Экспер и клин медицина 1990; 3: 32—34.
6. Contorshicova C. Antioxidant activity of Bufotin. In: Regulation of Inter. Conference on free radical reactionsю Abstract. Varna; 1989; p. 83—84.
7. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Дж. П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. Под ред. проф. А.С. Батуева. М; 1991; 400 с.
8. Родина В.И., Крупина Н.А., Крыжановский Г.Н., Окнина Н.Б. Новый метод оценки тревожно-фобических состояний у крыс. Ж высшей нервной деятельности. 1993; 43 (5): 1006—1017.
9. Кулагин Д. А., Фёдоров В. Н. Исследования эмоциональности у крыс линий Вистар, Крушинского—Молодкиной методом открытого поля. В кн.: Генетика поведения. Л: Наука; 1969; с. 35—42.
10. Рубанова Н. А., Риман Р. С. Роль биогенных аминов мозга в срочной адаптации к гипоксии. В кн.: Дегидрогеназы в норме и патологии. Горький; 1980; с. 57—62.
11. Методические рекомендации по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве антигипоксических средств. М; 1990; 18 с.
12. Меркулов Г.А. Курс патологической техники. Л: Медицина; 1969; 423 с.
13. Березовский В.А. Гипоксия и индивидуальные особенности. Киев: Наукова Думка; 1978; 215 с.
14. Лапшин Р.Д, Миронов А.А. Оценка уровня тревожности по устойчивости к гипобарической гипоксии крыс. В кн.: Регуляция и управление в биосистемах. Труды молодых ученых биологического ф-та ННГУ им. Н.И. Лобачевского. Н. Новгород; 1998; с. 111—112.
15. Боголепов Н.Н. Ультраструктура мозга при гипоксии. М: Медицина; 1979; 178 с.
16. Davis I.N., Carlsson F. The effect of hipoxia on monoamine synthesis, levels and metabolism in rat brain. J Neurochem 1973; 21 (6): 753—761.
17. Нагнибеда Н.Н. Активность симпатадреналовой системы. В кн.: Механизмы развития и компенсации гемической гипоксии. Под ред. А.З. Колчинской. Киев: Наук Думка; 1987; с. 59—75.
18. Brooderick P.A. Dopamine and serotonine in rat striatum during in vivo hypoxic-hipoxia. Metab Brain Dis 1989; 4 (2): 143—153.
19. Iijima S., Orimo H., Ito H., Sato A. Hipoxia increases extracellular dopamine and acetylcholine in the rat striatum. Biol Amine 1989; 6, (4): 309—314.
20. Strek K.F. Manipulation of serotonine protects against an hipoxia-indused deficit of a passive avoidance response in rats. Pharm Biochem Behav 1989; 33 (1): 241—244.
21. Парин С.Б. Роль эндогенной опиоидной системы в физиологических и повреждающих эффектах зоотоксинов. Дис…. канд. биол. наук. Горький; 1985.
22. Исмайлова Х.Ю., Гасанов Г.Г., Семенова Т.П. и др. Влияние локального введения 5,7-ДОТ и 6-ОДА в неокортексе на обучение и исследовательское поведение белых крыс в открытом поле. Журн высш нерв деятельности им. И.П. Павлова 1989; 39 (3): 548—555.
23. Jeste D.J., Smith J.P. Unilateral mesolimbicocortical dopamine deprivation decreases locomotion in the open-field and after amphetamine. Pharmacol Biochem Behav 1980; 12 (3): 453—457.
24. Крылов В.Н., Бояринов Г. А., Смирнов В. П., Снопова Л. Б. Влияние препарата жабьего яда на морфо-функциональное состояние органов и тканей экспериментальных животных. В кн.: Механизмы действия зоотоксинов. Горький; 1985; с. 72—76.
25. Крылов В. Н., Вальцева И. А., Давыдов В. Ф., Ошевенский Л. В., Петерсоне Э. Ю., Батова Р. С., Лаздынь А. А., Бояринов Г. А., Синицын Л. Н. Средство, обладающее кардиостимулирующим действием. Патент на изобретение № 2068697. Опубл. в БИ; 1996; № 31.