Л.Б.Снопова, Н.Д.Гладкова, Н.М.Шахова, Е.В.Загайнова, И.А.Кузнецова, Н.Н.Проданец, Р.В.Куранов, В.М.Геликонов, Г.В.Геликонов, И.В.Турчин, В.В.Сапожникова, В.А.Каменский

ЦНИЛ; Нижегородская государственная медицинская академия;
Институт прикладной физики РАН;
Областная клиническая больница им. Семашко, Нижний Новгород

Перспективные морфологические исследования в оптической когерентной томографии

Современные направления медицины, связанные с ранней диагностикой заболеваний, применением адекватных, минимально инвазивных, органосохраняющих способов лечения, обусловливают развитие новых методов получения изображения биотканей. Большое значение придается высокой разрешающей способности, безопасности, относительной дешевизне этих методов исследований, быстрому получению результатов. Известные методы визуализации биотканей, такие как рентгеновская компьютерная томография, магнитно-резонансная томография и ультрасонография, позволяют различать структурные особенности тканей в человеческом организме с пространственным разрешением 100—1000 мкм. Этого, однако, недостаточно для идентификации многих важных патологических процессов — атрофии, гиперплазии и метаплазии эпителия, отека и склероза соединительной ткани, и ранних неопластических изменений — дисплазии и микроинвазивного рака. В последнее время предпринимаются попытки приблизить разрешающую способность методов к клеточному уровню (~10 мкм), что стало возможным для ядерного магнитного резонанса с использованием сильного магнитного поля [1], конфокальной оптической микроскопии [2] и оптической когерентной томографии (ОКТ) [3]. Последний метод, на наш взгляд, имеет все предпосылки для того, чтобы стать самым перспективным в этом плане.

В начале 90-х гг., в связи с развитием в Институте прикладной физики Российской академии наук (ИПФ РАН) нового научного направления — фемтосекундной оптики — появились источники и техника визуализации процессов на сверхкоротких временных интервалах, что принципиально важно для когерентной томографии с пространственным разрешением на уровне 10 мкм. Благодаря сложившейся теоретической, экспериментальной и инженерной базе создались благоприятные условия для быстрого развития экспериментальных работ по ОКТ, начиная с лабораторной реализации этого метода до использования в разных областях науки.

В настоящее время наиболее ярко выглядит биомедицинская сфера его изменения. ОКТ становится перспективным диагностическим методом, дающим достоверную информацию о строении биологических структур [4].

Наибольший опыт клинического применения ОКТ в эндоскопии сегодня имеют группы, работающие в Главной массачусетской клинике и Гарвардской медицинской школе (Бостон, США), клиниках Университета CWR в Кливленде (Охайо, США), и группа нижегородских ученых — сотрудников отделения нелинейной динамики и оптики ИПФ РАН, НГМА, Областной клинической больницы им. Семашко и Областного онкологического диспансера. В 1999 г. работа была удостоена Государственной премии Российской Федерации в области науки и техники.

Биологические ткани являются прекрасным объектом для оптической томографии в диапазоне длин волн так называемого терапевтического окна прозрачности (0,75—1,3 мкм), где они сильно рассеивают и относительно слабо поглощают излучение. При этом удается получать изображения живых тканей на глубину 1,5—2 мм. Разрешение в 10—15 мкм позволяет различать структуру оптических неоднородностей, обусловленных вариациями коэффициента обратного отражения. Интерпретация этих изображений, с точки зрения морфологии, представляет интерес для клинического использования ОКТ.

Разрешающая способность ОКТ сравнима с нижней границей размеров клеточных элементов тканей, поэтому «золотым стандартом» для томографического изображения служит световая микроскопия гистологических срезов исследуемых органов.

Морфологи НГМА и ОКБ им. Семашко участвуют в работе по поиску параллелей между гистологическими и оптическими структурами с 1995 г., т.е. практически с момента зарождения ОКТ в Нижнем Новгороде.

Изучаются кожа, слизистые оболочки шейки матки, пищевода, мочевого пузыря, желудка, тонкого и толстого кишечника — все они имеют общие признаки гистологического строения: поверхностный плоский, переходный или цилиндрический эпителий, базальную мембрану, подлежащую соединительную ткань. Для гистологических исследований используется классическая обработка и окраска материала (фиксация в 10% нейтральном формалине, заливка в парафин, окраска гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону).

Установлено, что структура слизистых оболочек разных органов и кожи различной локализации имеет оптические эквиваленты и потому доступна для исследования с помощью ОКТ [4—7]. Например, состояние базальной мембраны, которое имеет особо важное значение при решении вопроса об инвазии рака, ОКТ позволяет наблюдать в слизистых оболочках, покрытых многослойным плоским или переходным эпителием [8, 9].

Известно, что патологические реакции, лежащие в основе подавляющего большинства болезней человека, являются общими. Томографически обнаружены некоторые оптические проявления таких реакций, как воспаление, некроз, опухолевый рост и другие [10].

Для интерпретации оптических изображений, полученных с помощью ОКТ, проводятся параллельные гисто-томографические исследования. Изучаются здоровые участки тканей человека в послеоперационном материале, прижизненному томографированию подвергаются участки тканей, которые подлежат эксцизионной биопсии или оперативному удалению. Такие исследования позволили установить, что послойная структура слизистых оболочек и кожи находит свое отображение на томограммах.

а	б

На рис.1 приведен пример параллельного гисто-томографического исследования участка слизистой оболочки шейки матки. На томограмме многослойный плоский эпителий имеет такую же высоту, что и на гистологическом изображении, отделен от нижележащей стромы ровной базальной мембраной. Благодаря градиенту яркости на границе эпителия и стромы ясно определяется положение базальной мембраны.

Применение специальных окрасок гистологических срезов позволяет выявлять отдельные структурные компоненты тканей и судить о состоянии их метаболизма. Такая дифференцировка в сочетании с параллельной прицельной ОКТ дает возможность четко определять характер и расположение оптических образов конкретных структур, присущих данному участку ткани.

В настоящее время получены гисто-томографические изображения слизистой оболочки нормального пищевода с применением избирательной окраски коллагеновых волокон, которая позволяет определить ориентацию коллагеновых волокон, параллельную поверхности слизистой оболочки в подэпителиальном слое соединительной ткани здорового пищевода (рис.2, в). Это объясняет наличие сильно рассеивающей полосы на ОКТ-изображении под слоем, соответствующим плоскому эпителию (рис.2, а).

а	б
в

Одним из направлений развития ОКТ является кросс-поляризационная томография, дающая изображение только тех тканевых структур, которые способны сильно деполяризовать падающее излучение [11]. Развитие такого вида томографических исследований обусловило привлечение гистохимических методов, с помощью которых выявляется локализация отдельных структурных компонентов ткани. При изучении раковых клеток с помощью кросс-поляризационной ОКТ установлено, что они слабо деполяризуют сигнал, соединительная ткань обладает существенно большей способностью к деполяризации. При исследовании аденокарциномы желудка выявлено, что обычная томография инвазивного рака дает бесструктурные изображения с быстро затухающим сигналом (рис. 3, а), а кросс-поляризационная томография обнаруживает яркие структуры на темном фоне (рис. 3, в), которые соответствуют прослойкам соединительной ткани между комплексами опухоли (рис. 3, б, г).

а	б
в	г

В настоящее время при дальнейшем изучении возможностей ОКТ мы вплотную приблизились к осознанию необходимости активного использования иммуногистохимических методов исследования. Это обусловлено трудностью диагностики процессов неоплазии на стадии тяжелой дисплазии и микроинвазивного рака в слизистых оболочках различной локализации и коже. Эта проблема является актуальной как для классической гистологической диагностики, так и для ОКТ. Есть основания предполагать, что выраженность неопластического процесса находит свое отражение в нарушении слоистой структуры изображения [9]. Ключевую роль при этом играют как состояние базальной мембраны, так и ответ соединительной ткани на неопластические изменения в эпителии. Поэтому нам представляются перспективными исследования молекулярных механизмов взаимоотношения системы эпителий—базальная мембрана—соединительная ткань. Применение иммуногистохимии позволит проводить более детальный и глубокий анализ ОКТ-изображений при подозрении на неоплазию.

Таким образом, развитие оптической когерентной томографии, которое идет по пути увеличения разрешающей способности, побуждает к использованию для интерпретации томографических изображений методов, применяемых в современной морфологии, патологической анатомии, физиологии и патофизиологии. Новая информация позволит точно и обоснованно трактовать оптические образы тканей и будет способствовать правильной постановке диагноза.

Литература

1. Bronzino J. The Biomedical engineering handbook. CRC Press, IEEE Press; 2000.
2. Tadrous P.J. Methods for imaging the structure and function of living tissues and cells: 3.Confocal microscopy and micro-radiology. Journal of Pathology 2000; 191: 345–354.
3. Huang D., Swanson E.A., Lin C.P., Schuman J.S., Stinson W.G., Chang W. et al. Optical Coherence Tomography. Science 1991; 254: 1178–1181.
4. Drezek R., Zuluaga A.F., Richards-Kortum R.R. Relationship between tissue microscopic structure and scattering properties: Implications for OCT imaging. In: B.E. Bouma, G.J. Tearney, editors. Handbook of optical coherence tomography. New York-Basel: Marcel Dekker, Inc.; 2002; p. 445—470.
5. Feldchtein F.I., Gelikonov G.V., Gelikonov V.M., Kuranov R.V., Sergeev A.M., Gladkova N.D. et al. Endoscopic applications of optical coherence tomography. Optics Express 1998; 3(6): 257–269.
6. Bouma B.E., Tearney G.J. Clinical imaging with optical coherence tomography. Academic Radiology 2002; 9(8): 942–953.
7. Gladkova N.D., Petrova G.A., Nikulin N.K., Radenska-Lopovok S.G., Snopova L.B., Chumakov Y.P. et al. In vivo optical coherence tomography imaging of human skin: norm and pathology. Skin Res Technol 2000; 6(1): 6–16.
8. Gelikonov V.M., Gelikonov G.V., Gladkova N.D., Leonov V.I., Feldchtein F.I., Sergeev A.M. et al., inventors; Optical Coherence Technologies, Inc., Cleveland, Ohio, assignee. Optical fiber interferometer and piezoelectric modulator. USA patent 5835642. 1998.
9. Sergeev A.M., Gelikonov V.M., Gelikonov G.V., Feldchtein F.I., Kuranov R.V., Gladkova N.D. et al. In vivo endoscopic OCT imaging of precancer and cancer states of human mucosa. Optics Express 1997; 1(13): 432–440.
10. Гладкова Н.Д., Загайнов В.Е., Загайнова Е.В., Кузнецова И.А., Петрова Г.А., Снопова Л.Б. и др. Способ диагностики in vivo патологической зоны в слоистой системе биологического органа эпителий-подлежащая соединительная ткань. Патент РФ 2169525; 2001.
11. Kuranov R.V., Sapozhnikova V.V., Turchin I.V., Zagainova E.V., Gelikonov V.M., Kamensky V.A. et al. Complementary use of cross-polarization and standard OCT for differential diagnosis of pathological tissues. Optics Express 2002; 10(15): 707–713.