Л.М. Белова, Ю.П. Потехина

Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия;
Государственная медицинская академия, Нижний Новгород

Исследование конформационных изменений молекулы альбумина в различных условиях методом клиновидной дегидратации(сообщение I)

  Альбумин является одним из основных белков плазмы крови человека. Одна из важнейших функций альбуминов — транспортная. Эти белки участвуют в переносе свободных жирных кислот, холестерина, многих биологически активных веществ. Они способны связываться с желчными пигментами, в частности с билирубином. Значительная часть кальция в сыворотке также связана с альбуминами. По-видимому, они способны связывать любые гидрофобные и амфифильные лиганды малой молекулярной массы (до 1000 Д) [1, 2]. Недавно выявлен новый вид патологических изменений в молекулах белков: их первичная структура нормальна, однако нарушена их вторичная и/или третичная структура (конформация) [3]. Таким образом, патологические процессы могут сопровождаться изменением состояния молекул альбумина плазмы крови. Иногда это является результатом загрузки альбумина токсическими продуктами, которые печень и другие органы детоксикации не успевают выводить (например, при гипербилирубинемии). Однако в большинстве случаев дело обстоит иначе: чрезмерной перегрузки альбумина метаболитами нет, но изменена конформация молекулы альбумина [3]. Белок с измененной конформацией не может эффективно выполнять свою транспортную функцию. Следовательно, весьма важно при лечении больных контролировать изменение конформации молекулы сывороточного человеческого альбумина.

  В 1996 г. С.Н. Шатохиной и В.Н. Шабалиным (НИИ геронтологии МЗ РФ) [4] был предложен метод клиновидной дегидратации. Он позволяет делать видимой молекулярную организацию биологических жидкостей путем перевода ее на макроуровень. Это осуществляется при высушивании капли биожидкости на твердой подложке. Образование сухой пленки — фации — подчиняется строгим закономерностям: количество солей увеличивается от периферии к центру, а количество органических веществ — от центра к периферии. Это происходит по следующим причинам:

  испарение жидкости идет равномерно по всей поверхности капли;

  в силу того, что капля имеет разную толщину слоя в центре и на периферии, количество воды уменьшается неравномерно — на периферии быстрее, чем в центре;

  гидрофильность солей больше, чем гидрофильность органических соединений, поэтому соли начинают перемещаться в центр капли, вытесняя органические вещества на периферию (рис. 1).

Рис. 1. Распределение неорганических солей и органических веществ в процессе высыхания капли биологической жидкости на твердой подложке [4]: а — сагиттальный разрез; б — вид сверху

  В результате продолжающегося испарения связанной воды в белковой основе фации могут возникать трещины [5]. Развиваются достаточно мощные процессы растяжения и сжатия в результате свертывания молекул белка. Разрыв полимерной пленки происходит в наиболее слабых и перенапряженных областях [6].

  Цель исследования — показать принципиальную возможность оценки состояния молекулы альбумина методом клиновидной дегидратации.

  Материалы и методы. 10% раствор сывороточного человеческого альбумина готовили, растворяя лиофилизированный кристаллический альбумин в бидистиллированной воде. Денатурацию белка вызывали прибавлением к его раствору различных количеств (в объемных соотношениях 10:1; 5:1; 2:1; 1:1) 8 М раствора мочевины. Изменение активной реакции среды осуществляли добавлением в объемном соотношении 1:1 буферов с различными рН (1,68; 3,56; 4,04; 4,6; 5,0; 6,8; 7,2; 7,5; 7,8; 8,0; 9,18; 12,45). Контролем служил 10% раствор альбумина с добавлением бидистиллированной воды в объемном соотношении 1:1. Кроме того, были изучены растворы альбумина, предназначенные для трансфузии, с различными сроками годности.

  Проводилось исследование растворов альбумина методом клиновидной дегидратации [4]. На предметное стекло, специальным образом обработанное, наносили 0,01 мл исследуемой жидкости. Делали 4 повтора для проверки идентичности картин высохшей капли (фации). Высушивание проводили в течение 24—48 ч при комнатной температуре вдали от нагревательных приборов и прямых солнечных лучей. Фации исследовали с помощью оптического микроскопа в проходящем свете. Параллельно измеряли вязкость с помощью ультразвукового микровискозиметра (разработка Института прикладной физики РАН). Для обозначения вязкости использовали единицы измерения сантипуазы (спз), 1 спз равен 10–3 Па·с в системе СИ.

  Результаты. Картина высохшей капли 10% свежеприготовленного раствора альбумина (рис. 2, а) характеризуется наличием значительного количества радиальных трещин, которые по краю фации образуют арки.

  При старении альбумина увеличивается вязкость, уменьшается размер краевой зоны фации, появляются трещины нетипичной формы (прямые, круговые), патологические особенности (линии Валнера, параллельные и штриховые трещины), кристаллы в центральной зоне, нарушается радиальность и равномерность расположения трещин. Так, у фации 10% раствора альбумина, срок годности которого истек в 1990 г. (рис. 2, б) появляются концентрические массивы игольчатых кристаллов в центральной зоне; резко уменьшается число трещин, нарушается равномерность их расположения и исчезают аркообразные формы по краю фации.

  Прибавление 8 М раствора мочевины вызывает резкое снижение общего количества трещин в фации раствора альбумина и уменьшение размера краевой зоны (рис. 3). По мере увеличения концентрации мочевины в пробе вязкость жидкости возрастает (рис. 4). Подобные изменения были присущи всем изученным растворам альбумина.

  При добавлении к раствору альбумина буферов с различной кислотностью наблюдалось значительное изменение числа и длины трещин (рис. 5). Характерно резкое снижение общего количества трещин фации и рост вязкости при крайних значениях рН (1,68; 9,18; 12,45), а также при рH, близкой к изоэлектрической точке данного белка, равной 4,7.

  Обсуждение. Высохшие капли растворов, не содержащих белки, не имеют трещин. Не выявлено трещин и в высохшей капле растворов аминокислот [7]. Высохшие пленки растворов различных белков имеют специфичные морфологические параметры, в частности количество и характер трещин [7, 8]. Данное свойство обусловлено специфичной структурой макромолекулы белка [8].

  Мочевина вызывает глубокую денатурацию (с потерей четвертичной, третичной и, возможно, вторичной структуры) молекулы белка за счет расщепления дисульфидных связей [2]. Прибавление ее к раствору альбумина приводит к уменьшению ширины краевой зоны и общего количества трещин, вплоть до полного их исчезновения, и росту вязкости. Таким образом, глубокое нарушение структуры белка сопровождается изменениями этих параметров фации.

  Менее значительные изменения в структуре белковой молекулы были вызваны изменением кислотности раствора. С приближением рН раствора белка к изоэлектрической точке его набухаемость, растворимость, вязкость и многие другие характеристики принимают экстремальные значения. Изоэлектрическая точка альбумина равна 4,7. Поэтому резкое снижение количества и длины трещин в высохшей капле раствора белка, рост его вязкости при рН=4,6, весьма показательны. Видимо, подобные экстремальные значения данных показателей именно при рН, практически равном изоэлектрической точке, связаны с резким изменением конформации белковой молекулы в этой точке. Известны 5 конформаций альбумина, которые могут переходить друг в друга при изменении рН [9]. Изменение рН белкового раствора приводит к изменению пространственной конфигурации белковой молекулы, что в наших опытах сопровождалось изменением количества трещин и вязкости.

  Старение препарата также сопровождается изменением количества и характера трещин в картине высохшей капли. Аналогичные изменения наблюдаются при старении синтетических полимеров [10]. Вероятно, процесс старения белкового раствора сопровождается изменением конформационной структуры его молекул.

  Из различных гидродинамических свойств растворов макромолекул ни одно не связано с их формой столь же тесно, как вязкость. Молекулы высокомолекулярных соединений в развернутом состоянии придают растворам более высокую вязкость, чем свернутые в спираль или клубок. Изменения вязкости растворов в наших экспериментах еще раз подтверждают изменения конформационной структуры белковых молекул.

  Таким образом, изменение конформации макромолекулы белка при испарении связанной воды будет приводить к изменению типа и количества трещин. Следовательно, можно предположить, что имеет место взаимосвязь конформации молекул белка и характера трещин фации.

  Заключение. Проведенное исследование позволяет сделать следующие выводы:

  1. Конформационые изменения структуры макромолекулы альбумина отражаются на вязкости, характере и количестве трещин фации его раствора.

  2. Метод клиновидной дегидратации обладает высокой чувствительностью к изменению конформации белковых молекул, что позволяет использовать его для исследования данного показателя в плазме крови больных в целях диагностики и контроля за лечением.

Литература

1.   Добрецов Г.Е., Миллер Ю.И. Биохимия и физико-химия сывороточного альбумина. Центры связывания органических молекул. В кн.: Альбумин сыворотки крови в клинической медицине. Книга 1. Под ред. Ю.А. Грызунова и Г.Е. Добрецова. М: ИРИУС; 1994; с.13—28.

2.   Степанов В.М. Молекулярная биология. Структуры и функции белков. М: Высшая школа; 1996; 335 с.

3.   Лопухин Ю.М., Добрецов Г.Е., Грызунов Ю.А. Конформационные изменения молекулы альбумина: новый тип реакции на патологический процесс. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2000; 7: 4—9.

4.   Шатохина С.Н., Шабалин В.Н. Ранняя диагностика уролитиаза, определение степени его активности и состава камнеобразующих солей мочи (система Литос). Урология и нефрология 1998; 1: 19—23.

5.   Бартенев Г.М., Френкель С.Я. Физика полимеров. Л: Химия; 1990; 450 с.

6.   Гуль В.Е. Структура и прочность полимеров. М: Химия; 1987; 328 с.

7.   Rapis E.G., Gasanova G. Yu. Autowave process in the dynamics of phase transition in a protein film. Sov Phys Tech Phys 1991; 36(4): 406—412.

8.   Rapis E. Symmetry and self-organization in protein. Symmetry. Culture and Science 1995; 6(3): 439—441.

9.   Комарова М.Н., Грызунов Ю.А. Строение молекулы альбумина и ее связывающих центров (обзор литературы). В кн.: Альбумин сыворотки крови в клинической медицине. Книга 2. Под ред. Ю.А. Гры­зунова и Г.Е. Добрецова. М: ГЭОТАР Медицина; 1998; с.28—51.

10.   Бузоверя М.Э., Шатохина С.Н., Шабалин В.Н. Кристаллографические методы в изучении феномена старения природных и синтетических полимеров. В кн.: Материалы науч.-практ. конференции «Проблемы геронтологии». Пушкино; 1998; c.133—140.