Ю.П. Потехина, Т.Г. Щербатюк

Нижегородская государственная медицинская академия; ЦНИЛ, Нижний Новгород

Исследование методом клиновидной дегидратации плазмы крови при длительном хранении и при различных воздействиях in vitro (сообщение II)

Высокая относительная вязкость плазмы (1,9—2,8 при относительной вязкости воды, равной 1) почти целиком обусловлена белками — самыми сложными и важными компонентами. Белки выполняют трофическую, транспортную функции, создают онкотическое давление, играющее важную роль в регуляции распределения воды между плазмой и межклеточной жидкостью, как амфотерные вещества белки поддерживают постоянство рН, они участвуют также в свертывании крови и иммунном ответе [1]. Вследствие этого плазма крови и ее компоненты широко используются для инфузионной терапии. Количество перелитой плазмы в последние годы возрастает во всем мире. Для переливания используют свежезамороженную плазму. Это плазма, полученная от одного донора методом плазмафереза или из консервированной крови посредством ее центрифугирования, и замороженная при температуре –45°С в течение первых 4 ч с момента пункции вены. Такую плазму можно хранить 3 мес при температуре от –18 до –25°С [2].

Метод клиновидной дегидратации, описанный нами в сообщении I*, использовался для исследования сыворотки крови в процессе ее хранения в течение 12 сут при температуре 6—8°С [3]. Интерес представляет изучение состояния структурной самоорганизации плазмы крови при длительном хранении в замороженном состоянии.

Цель работы — исследовать морфологическую картину фации при длительном хранении плазмы крови в замороженном состоянии и ее изменения при различных воздействиях на длительно хранившуюся плазму.

Материалы и методы. В качестве объекта исследования использовали донорскую плазму — свежую и свежезамороженную, хранившуюся в течение 3 мес на Станции переливания крови. Свежую плазму также замораживали и хранили в течение 3 мес при температуре –18°С с целью проследить изменения морфологической картины. Изменения оценивали методом клиновидной дегидратации через сутки, через неделю, через месяц и через 3 месяца.

Воздействия осуществляли на длительно хранившуюся свежезамороженную плазму в условиях in vitro. Производили барботирование плазмы в объеме 3 мл в течение 3 мин кислородом и озоно-кислородной смесью. Были использованы следующие концентрации озона в озоно-кислородной газовой среде: 48, 100, 320, 400, 540, 780, 1120, 1500, 3580, 4990 мкг/л, что соответствует положениям усиления озонатора — 1—10 (производитель ННИПИ). Изменения в плазме оценивали методом клиновидной дегидратации сразу после воздействия, через 10, 30, 60, 90, 120 и 150 мин.

Результаты. Фация плазмы крови здорового донора характеризовалась наличием значительного количества радиальных трещин, которые по краю фации образовывали арки (рис. 1).

Рис. 1. Фация плазмы крови здорового донора, 325

Эта картина сходна с описанной В.Н. Шабалиным и С.Н. Шатохиной морфологической картиной сыворотки крови здорового человека [3].

При хранении плазмы в замороженном состоянии структура ее фации изменялась следующим образом (рис. 2):

Рис. 2. Фация плазмы крови здорового донора после хранения плазмы в замороженном виде, 325: А — через сутки, Б — через неделю, В — через месяц, Г — через 3 мес

А

Б

В

Г

через сутки в фации плазмы уменьшалось количество трещин, их форма и расположение оставались прежними (рис. 2, А), через месяц хранения увеличилось количество трещин также без изменения формы и расположения (рис. 2, В). Через 3 мес хранения плазмы структура ее фации резко изменялась: в периферической зоне появлялась сеть ломанных мелких трещин, в центральной зоне — мелкозернистая подложка и небольшое количество мелких трехлучевых трещин (рис. 2, Г).

При исследовании методом клиновидной дегидратации свежезамороженной плазмы, хранившейся на Станции переливания крови в течение 3 мес, оказалось, что структура ее фации сходна с показанной на рис. 2, Г. После трехминутной обработки этой плазмы кислородом картина фации становилась очень похожей на картину фации свежей плазмы (рис. 3).

Рис. 3. Фация длительно хранившейся плазмы здоровых доноров после обработки плазмы кислородом,325

После воздействия озона на эту плазму в большинстве случаев картина фации становилась более упорядоченной и гармоничной, хотя о восстановлении ее структуры говорить было сложно (рис. 4).

Рис. 4. Фация длительно хранившейся плазмы здоровых доноров после обработки плазмы озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 540 мкг/л, 325

Особенно выраженными изменения были при барботировании плазмы озоно-кислородной смесью с концентрациями 320 и 540 мкг/л через 10 мин после воздействия, 780 мкг/л — через 30 мин, и 1120 мкг/л — через 90 мин после озонирования. Низкие концентрации озона (48 и 100 мкг/л) к таким изменениям не приводили, размер и направление трещин фации практически не изменялись. Обработка плазмы озоно-кислородной смесью с высокими концентрациями озона (3580 и 4990 мкг/л) приводила к еще большей аморфизации структуры фации (рис. 5).

Рис. 5. Фация длительно хранившейся плазмы здоровых доноров после обработки плазмы озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 4990 мкг/л, 325

Обсуждение. При исследовании 10% раствора альбумина нами было установлено, что изменение количества и формы трещин его фации связано с изменениями конформации молекул белка. М.В. Пашков, Д.В. Василенко [4] при изучении спектрограммы плазмы, хранившейся в замороженном состоянии в течение суток (ультра­фиолетовая спектрофотометрия является методом исследования конформации и конформационных переходов белков [5]), отметили до­стоверное снижение экстинкций на 60—80% от исходных значений. Максимальное их падение наблюдалось в диапазоне волн 238—242 нм. В этой связи наблюдаемое нами изменение количества трещин фации, которое наступает уже через сутки после хранения плазмы в замороженном состоянии, скорее всего связано с конформационными изменениями белковых молекул. Аналогичные изменения происходили в течение месяца. Грубые изменения картины фации при длительном хранении плазмы (3 мес) могут говорить о более глубоких нарушениях, вызванных процессами, сходными со старением.

Плазма крови является многокомпонентной системой, основными составляющими которой являются вода, белки (»7%), неорганические соли (»0,9%) и небелковые органические соединения [6]. По своему составу плазму можно сравнить с дисперсиями полимеров. Старение органических материалов, как в растворах, так и в пленках из дисперсий полимеров, имеет определенные закономерности. В начальной стадии старения наблюдается более четкое проявление надмолекулярных структур, а также формирование новых структурных элементов, которые имеют тенденцию располагаться в определенном порядке. Последующее старение органической матрицы сопровождается агрегированием структурных элементов и образованием более сложных морфологических форм, появлением границ раздела. На заключительной стадии старения наблюдается распад структурных образований, аморфизация материала [7].

По-видимому, в фации плазмы, хранившейся 3 мес, мы наблюдали одну из промежуточных стадий старения — аморфная центральная зона и мелкие ломаные трещины в периферической зоне. То, что это не последняя стадия, доказывает наблюдаемая нами тенденция к восстановлению картины фации после обработки плазмы кислородом или озоно-кислородной смесью.

Кислород и озон являются окислителями, которые могут взаимодействовать со всеми органическими соединениями, в том числе свободными аминокислотами и пептидами, ненасыщенными жирными кислотами и др. Обнаружены селективные свойства озона по отношению к соединениям, имеющим двойные связи, и прежде всего к полиненасыщенным жирным кислотам. Основными продуктами, образующимися при взаимодействии озона с ненасыщенными жирными кислотами, наряду с озонидами являются гидропероксиды, которые отличаются от аутогенных своей короткоцепочечностью и гидрофильностью [8].

Полученные результаты согласуются с ранее опубликованными. Так, С.П. Перетягиным в экспериментах in vitro было показано, что воздействие на кровь озоно-кислородной смеси в диапазоне концентраций от 8 до 200 мкг/л не влечет за собой нарушений пептидных связей, но вызывает конформационные перестройки белковых молекул [9]. В наших экспериментах так же низкие концентрации приводили к незначительным изменениям картины фации плазмы. Барботирование плазмы с использованием чистого кислорода и средних концентраций озона в озоно-кислородной смеси влекло за собой упорядочение и гармонизацию структуры фации. Очень высокие концентрации озона приводили к аморфизации структуры фации, что может быть связано с разрушением органических молекул. Для объяснения этих эффектов необходимо проведение дальнейших исследований.

Заключение. исследования методом клиновидной дегидратации показали, что при хранении свежезамороженной плазмы крови в течение месяца в ней происходят лишь конформационные изменения белковых молекул. Хранение плазмы в течение 3 мес приводит к более грубым изменениям ее фации, следовательно к более значительным нарушениям в химической структуре молекул. Обработка длительно хранившейся плазмы кислородом или озон-кислородной смесью со средними концентрациями озона приводит к упорядочиванию и гармонизации структуры фации.

Литература

1. Вайс Х., Елькман В. Функции крови. В кн.: Физиология человека. В 3-х тт. Пер. с англ. Под ред. Р.Шмидта и Г.Тевса. Т.2. М: Мир; 1996.
2. Жибурт Е.Б. Трансфузиология. Учебник. СПб: Питер; 2002; 736 с.
3. Шабалин В.Н., Шатохина С.Н. Морфология биологических жидкостей человека. М: Хризостом; 2001; 304 с.
4. Пашков М.В., Василенко Д.В. Влияние внешних факторов на результаты метода ультрафиолетовой спектрофотометрии кислотоустойчивых фракций. В кн.: Новое в диагностике и лечении заболеваний. Сборник научных трудов студентов, посвященный 80-летию Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н.Бурденко. http://www.vsma.ac.ru/publ/1998/80lvsma_st.
5. Демченко А.П. Ультрафиолетовая спектрофотометрия и структура белков. Киев: Наукова думка; 1981; 208 с.
6. Основы биохимии. В 3-х т. Т. 3. Пер. с англ. А.Уайт и соавт. М: Мир; 1981; 726 с.
7. Бузоверя М.Э., Шатохина С.Н., Шабалин В.Н. Кристаллографические методы в изучении феномена старения природных и синтетических полимеров. В кн.: Проблемы геронтологии: Материалы науч.-практ. конф. Пушкино; 1998; с. 133—140.
8. Wolff H.H. Das medizinische Ozon. Heidelberg: E. Fischer Verlag; 1979; 583 S.
9. Перетягин С.П. Патофизиологическое обоснование озонотерапии постгеморрагического периода: Автореф. дис. … докт. мед. наук. Казань; 1991.